Nawigacja: alergologia.org > archiwum > IV Zimowe Warsztaty Sekcji Dermatologicznej PTA
Na przestrzeni ostatnich lat obserwujemy niezwykle owocny rozwój badań poznawczych patogennych drobnoustrojów, co jest ściśle związane z ogromnym postępem w dziedzinie genomiki i proteomiki. Dzięki temu rośnie w szybkim tempie liczba gatunków drobnoustrojów, w tym również grzybów, dla których poznano pełną sekwencję nukleotydową ich genomów. Jednak dopiero w czerwcu 2006 roku na Kongresie Mikologicznym w Paryżu (ISHAM) przedstawiono nowe, interesujące dane na temat genomiki Trichophyton rubrum (Wang L. 2006; Zaugg C. et al. 2006; Ball L. et al., 2006). Informacje te stały się silnym impulsem dla formułowania, nowych ważnych projektów badań poznawczych, dotyczących szczególnie molekularnej diagnostyki i epidemiologii dermatofitów, mechanizmów i czynników ich chorobotwórczości, mechanizmów lekooporności, a także poszukiwania specyficznych tarcz molekularnych, umożliwiających syntezę nowych, skutecznych leków. Zgodnie z wynikami prezentowanymi na wyżej wspomnianym Kongresie przez Wanga, a następnie opisanymi w pracy doświadczalnej opublikowanej pod koniec 2006 roku wynika, iż udało się skonstruować 10 dużych bibliotek cDNA szczepu T. rubrum, hodowanego w różnych warunkach wzrostu, oraz zidentyfikować i zsekwencjonować wiele genów, w tym odpowiedzialnych za chorobotwórczość.
Metody molekularne wykorzystywane w diagnostyce i epidemiologii zakażeń grzybami chorobotwórczymi opierają się na analizie polimorfizmu określonych markerów genetycznych, a zatem na poszukiwaniu unikalnych sekwencji nukleotydowych w DNA, specyficznych dla rodzaju, gatunku, a nawet szczepu. Najpopularniejszym markerem jest sekwencja ITS1-5.8S-ITS2 rDNA wykorzystywana w reakcji PCR dla identyfikacji i taksonomii wielu grzybów. Marker ten i techniki PCR z dużym powodzeniem stosuje się w ostatnich latach także w diagnostyce i taksonomii dermatofitów. W czasie wykładu przedstawi się nasze wyniki identyfikacji dużej kolekcji dermatofitów izolowanych od pacjentów z regionu łódzkiego, przy pomocy wyżej wymienionej techniki, zmodyfikowanej we własnym zakresie.
W literaturze przedmiotu, nie ma jak dotąd informacji na temat technik genetycznych, które mogłyby pozwolić na różnicowanie szczepów wewnątrz poszczególnych gatunków dermatofitów. Z drugiej strony, poznanie struktury klonalnej szczepów w obrębie określonego gatunku jest nieodzowne dla dochodzeń epidemiologicznych zakażeń, to jest dla ustalania źródeł infekcji i dróg transmisji patogenów. W naszym Zakładzie, we współpracy z Zespołem profesora Józefa Kura z Politechniki Gdańskiej, udało się opracować bardzo dobrą, nową metodę molekularną, która w świetle wstępnych wyników pozwala po raz pierwszy na głębokie, wewnątrz gatunkowe różnicowanie szczepów z rodzaju Trichophyton.
Początek badań w dziedzinie genetyki molekularnej grzybów datuje się, co prawda, na późne lata 70-te ubiegłego wieku, kiedy to opracowano pierwszy system dla skutecznej transformacji Saccharomyces cerevisiae, poprzez skonstruowanie bifunkcyjnego plazmidu zdolnego do replikacji zarówno w E. coli jak i w komórkach drożdży, a następnie stosunkowo krótkim okresie czasu, opracowano techniki transformacji modelowych grzybów Neurospora crassa oraz Aspergillus nidulans. Natomiast pierwsza praca na temat transformacji dermatofitów ukazała się dopiero w 1989 roku, z wykorzystaniem protoplastów Trichophyton mentagrophytes i bifunkcyjnego plazmidu noszącęgo gen hygromycyny B jako marker selekcyjny.
Pomimo, iż wyniki cytowanej wyżej pracy stworzyły pewne możliwości dla konstrukcji, co prawda z bardzo niewielką częstością, transgenicznych szczepów tego gatunku , to jednak aż do roku 2004 było to jedyne doniesienie na ten temat. Dopiero w 2004 i 2005 roku, w trzech niezależnych ośrodkach naukowych (Hiszpania, Izrael, Japonia) udało się stabilnie transformować protoplasty T. mentagrophytes i Microsporum canis zliniowaną formą skonstruowanych wektorów integracyjnych, zgodnie z procedurą REMI (Restriction Enzyme-Mediated Integration).
W naszym Zakładzie udało się w ostatnim czasie opracować, po raz pierwszy, system stabilnej transformacji szczepów Trichophyton rubrum, z wykorzystaniem odpowiedniego wektora integracyjnego, noszącego reporterowy gen gfp, oraz homogenenej zawiesiny kompetentnych, podkiełkowanych zarodników, bez konieczności stosowania niezwykle pracochłonnej i uciążliwej techniki dla otrzymywania protoplastów bądź sferoplastów.
Wyniki tych, unikatowych w Polsce poszukiwań naukowych dowodzą, że obecnie możemy z powodzeniem prowadzić diagnostyczne, epidemiologiczne i poznawcze badania dermatofitów z wykorzystaniem nowoczesnych metod molekularnych i genetycznych. Sądzimy, że w niedalekiej przyszłości podejmiemy podobne badania także innych grzybów chorobotwórczych i biotechnologicznych.
Jak cytować ten artykuł: Dobrowolska A, Stączek P, Kozłowska M, Jaworski A. Badania genetyczne dermatofitów: molekularna identyfikacja i różnicowanie szczepów z rodzajów Trichophyton, Epidermatophyton, Microsporum, wektory i systemy genetycznej transformacji Trichophyton sp. IV Ogólnopolskie Warsztaty Naukowo-Szkoleniowe Sekcji Dermatologicznej PTA, Słupsk-Ustka 7-10 lutego 2008. URL: http://www.alergologia.org/archiwum/2008wpta/wpta826.html (Dokument elektroniczny).
Nawigacja: alergologia.org > archiwum > IV Zimowe Warsztaty Sekcji Dermatologicznej PTA
© Anita Dobrowolska, Paweł Stączek, Magdalena Kozłowska, Adam Jaworski (tekst) & Radosław Śpiewak (kod źródłowy)
Ta strona jest częścią Portalu Alergologicznego alergologia.org (kontakt).
Dokument utworzony 18 stycznia 2008, ostatnia aktualizacja 19 stycznia 2008.
Korzystanie wyłącznie na zasadach podanych w zastrzeżeniu praw autorskich
oraz wykluczeniu odpowiedzialności!